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分子生物学——常规PCR疑难问题解读
Q:扩增无条带的解决办法

A:PCR扩增需要模板、引物、及PCR Mix等。因此可以从上述物质的配制及反应条件中找答案。包括:

1)模板质量不佳,含有PCR抑制剂成分或浓度过高。解决方法:模板含PCR抑制剂,则纯化模板或稀释模板后使用;浓度过高,则减少模板加入量。

2)引物设计不合适或引物退火温度设置过高。解决方法:优化反应程序或重新设计引物。

3)超出产品适用范围。扩增基因复杂度过高。过高GC含量或连续重复碱基的出现。(增加高GC含量测试数据中...)

4)延伸时间短,建议基因克隆60s/kb,基因鉴定30s/kb。

5)产品失效。使用之前测试过的引物和模板进行阳性对照实验。


Q:扩增产量低的解决办法

A:PCR扩增需要模板、引物、及PCR Mix等。因此可以从上述物质的配制及反应条件中找答案。包括:

1)模板浓度过高或过低。抑制PCR反应或达不到最佳扩增效率。解决方法:优化模板加入量。

2)延伸时间短,建议基因克隆60s/kb,基因鉴定30s/kb。


Q:出现抹带的解决办法

A:PCR扩增需要模板、引物、及PCR Mix等。因此可以从上述物质的配制及反应条件中找答案。包括:

1)模板降解、浓度过高或过低。抑制PCR反应或达不到最佳扩增效率。解决方法:优化模板加入量。

2)退火温度偏低,提高退火温度。

3)循环次数过多。适当减少循环数。


Q:出现非特异性扩增,怎么办?

A:PCR扩增需要模板、引物、及PCR Mix等。因此可以从上述物质的配制及反应条件中找答案。包括:

1)引物特异性差,或引物加入量过高。重新设计引物,降低引物加入量。

2)退火温度偏低,提高退火温度。

3)循环次数过多。适当减少循环数。


Q:如何解决NTC有扩增的问题?

A:NTC是指No Template control,不加模板的阴性对照实验。NTC出现扩增,说明PCR体系有污染,污染源包括: 

1)气溶胶污染。频繁扩增某一个基因,易导致局部气溶胶。解决方法:使用含UNGase的PCR Mix。

2)引物或模板的交叉污染。


Q:如何解决NTC有扩增的问题?

A:NTC是指No Template control,不加模板的阴性对照实验。NTC出现扩增,说明PCR体系有污染,污染源包括:

1)气溶胶污染。频繁扩增某一个基因,易导致局部气溶胶。解决方法:使用含UNGase的PCR Mix。

2)引物或模板的交叉污染。

3)来源于试剂的污染。








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