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分子生物学——荧光定量PCR疑难问题解读

Q:如何评判qPCR实验结果的有效性?


A:主要看以下两个指标。

1)Ct值:阳性:15<Ct<30,阴性对照:Ct>35。

2)融解曲线:单一峰。


Q:为什么Ct值偏大(CT值≥30)


A:可能有以下原因。

1)模板量低:减少稀释倍数或增加模板量,使Ct值尽量落在15-30之间。

2)扩增效率低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序或重新设计引物。

3)PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内,不建议超过300bp。

4)体系中存在抑制剂:加大模板稀释倍数或重新制备模板重复实验。


Q:为什么扩增曲线不稳定,平台期出现锯齿状?


A:可能有以下原因。

1)RNA纯度低:稀释模板或换用高纯度RNA。

2)仪器长时间未做校准:定期(一般1年)进行仪器校准保养。


Q:为什么扩增曲线无法达到平台期?


A:可能有以下原因。

1)模板量太低:提高模板量。

2)循环次数太少:提高循环次数。

3)试剂扩增效率低:做标准曲线测定试剂的扩增效率。


Q:为什么扩增曲线平台期荧光值下降?


A:可能有以下原因。

1)模板不纯:提高体系纯度或稀释模板。

2)模板量过高:降低模板量。


Q:为什么有融解曲线,无扩增曲线?


A:未在延伸阶段收集荧光信号:重新实验收集荧光信号。两步法扩增程序一般在退火延伸阶段收集,而三步法扩增程序在延伸阶段收集。


Q:为什么阴性对照有扩增?


A:可能有以下原因。

1)反应体系被污染:逐一做对比实验,排除污染源。

2)引物二聚体:若融解曲线Tm值<80℃,阴性对照CT>35,属正常情况。


Q:为什么融解曲线出现双峰?


A:可能有以下原因。

1)若较低峰Tm在80℃之前,则可能存在引物二聚体:可通过提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式调整实验。

2)若双峰Tm都在80℃以后,则可能:①引物特异性过差:Blast检查引物特异性,重新设计引物。②有gDNA污染:重新制备模板。                                         


Q:为什么融解曲线是单峰,但峰不尖锐?

A:存在大小相近的非特异性扩增:进行高分辨率琼脂糖电泳,确认是否为单一条带。


Q:为什么有扩增曲线,无融解曲线?


A:融解曲线未选择收集荧光信号:重新实验,在仪器正确的位置处收集荧光信号,大多仪器是选择照相机按钮。Roche仪器需在融解曲线设置最后一步95℃处的acquisition MODE为continues。


Q:为什么融解曲线初期时峰就很高?


A:ROX添加不当:可通过设置NO ROX模式后看曲线是否正常,若正常表示ROX添加错误,可调整ROX的含量。


Q:为什么融解曲线峰型杂乱


A:可能有以下原因。

1)反应体系污染:在无模板洁净区内配制体系,做好阳性、阴性对照。

2)试剂失效:避免将试剂暴露在强光或高温下。

3)仪器长时间未做校准:定期(一般1年)进行仪器校准保养。

4)耗材与仪器不匹配:选用与仪器匹配的耗材。


Q:为什么技术性重复性差?


A:可能有以下原因。

1)加样误差:模板稀释,提高加样体积。扩大反应体系。使用精准移液枪。

2)模板量低:提高模板量。

3)仪器长时间未做校准:定期(一般1年)进行仪器校准保养。 




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