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提取+建库!FFPE样本文库制备一站式解决方案!

肿瘤样本是检测基因突变的载体,世界肿瘤发病率居高不下,而医院的低温储存设备捉襟见肘,福尔马林浸泡,石蜡包埋的样本(FFPE)能在常温长时间储存,更受广大临床医生欢迎。据统计,世界各地医院积攒了约4亿FFPE样本,但是福尔马林的固定、石蜡高温浸入、较长保存时间都会导致DNA的交联和不同程度降解,如何从这些海量样本中提取高质量DNA,然后建库测序并分析成为了棘手问题。im体育App深耕生命科学领域多年,基于自身深厚的工具酶技术和经验积累,为FFPE DNA的NGS检测提供完整解决方案。


图1.FFPE DNA实验、分析.jpg

图1. FFPE DNA实验、分析


FFPE DNA提取


FFPE DNA提取需经历脱蜡、酶消化、DNA提取共3个步骤。经过潜心优化和精心打磨,im体育App重磅推出FFPE DNA提取试剂盒——MolPure? Magnetic FFPE DNA Kit(鄂汉械备20210919号)。在FFPE脱蜡步骤中,目前市场上常用的脱蜡方式是二甲苯,其强烈刺激性气味,强烈刺激人体食道和胃,并引起呕吐,本试剂盒采用无毒脱蜡液取代二甲苯脱蜡功效,为实验人员健康保驾护航;在酶消化步骤中,im体育App采用精心优化提取体系,确保蛋白酶K能充分消化蛋白和相应核酸酶,保证DNA最大程度释放和不被核酸酶消化,这一点直接体现在最终DNA产量上面。结果显示,im体育App提取总量最高。


图2 各试剂盒提取FFPE DNA结果.jpg

图2. 各试剂盒提取FFPE DNA结果

在DNA提取步骤中,传统的手段有酚氯仿抽提、柱膜法、磁珠法,基于未来大样本量自动化应用场景考量,im体育App采用独家磁珠混合液,操作简便,保证提取DNA纯度,且完美兼容自动化核酸提取仪,大幅提升大样本量FFPE DNA提取效率。


FFPE DNA文库构建



 1   酶切法建库

FFPE DNA一般需要打断才能建库和机械法打断相比,酶切法更温和更高效,对片段损伤更小,且不需要专门打断仪器和耗材,降低了实验成本。针对不同测序平台,im体育App均布局了酶切建库解决方案,助力客户简单高效进行建库实验。针对Illumina平台,im体育App推出Hieff NGS? OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina?,采用最新优化的连接酶、最新型高保真酶,改善接头连接时的片段自连并进一步提升扩增的均一性和保真性,持续提升测序结果质量。针对日益普及的MGI平台,im体育App推出Hieff NGS? OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI?酶切法),满足客户对不同测序平台建库需求。

33333333.jpg

图3. 文库产出(50ng FFPE DNA)

 图4 文库测序下机结果.jpg

图4.文库测序下机结果


 2   建库接头

建库完成后的混样测序中,index(或称barcode)是区分各个样本的“身份证”,通常只有几个碱基差异,而实验操作引入的index污染、PCR扩增误差、测序扩增误差均造成标签跳跃 (index hopping),单端index长接头、双端组合接头CDI(Combinational Dual Index)在区分测序样本来源能力较为薄弱。针对这个测序中频发的难题,在illumina和MGI测序平台,im体育App均布局双端特异性接头UDI(Unique Dual Index产品,例如,Hieff NGS? Stubby UDI Primer Kit for Illumina?双端特异性接头多达384种,完全满足检测需求。结合文库QC,保证低污染的文库进行混样和测序,将大幅降低index hopping带来的实验困扰,助您实验无忧。

图5. UDI识别index hopping的原理.jpg

图5. UDI识别index hopping的原理


 3   DNA磁珠

磁珠纯化是建库关键环节之一,Hieff NGS? DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理,通过精心优化过的缓冲体系,可用于DNA文库片段分选、纯化,和目前广泛使用的AMPure XP Beads使用方式相同,片段回收效率和文库大小分布均高度吻合,因此可无缝替代AMPure XP Beads,有效降低建库成本。

表1.不同品牌磁珠在不同比例下回收效率比较

磁珠比例

Input DNA (ng)

Yeasen

Be*

Va*

Vd*

Tr*

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

1.8×

535

534.4

99.89%

524.8

98.09%

518.4

96.90%

566.4

105.87%*

534.4

99.89%

1.2×

518.4

96.90%

537.6

100.49%*

521.6

97.50%

528

98.69%

505.6

94.50%

0.8×

499.2

93.31%

406.4

75.96%

416

77.76%

464

86.73%

425.6

79.55%

0.6×

326.4

61.01%

210.56

39.36%

281.6

52.64%

283.52

52.99%

247.04

46.18%

【注】:DNA Marker中含loading等物质,影响核酸定量,因而初始的Input定量结果偏低,所以表中出现回收效率略高于100%。


 4   文库定量

核酸定量在NGS实验流程很常见。Qubit常用于提取DNA和文库初步定量,im体育App推出dsDNA HS Assay Kit for Qubit?可实现0.2-100 ng双链DNA(dsDNA)快速、精确的定量,操作简单,结果可靠,同时为了进一步提高实验便捷性,亦可提供预混液版本定量试剂;此外因为文库纯化后可能存在一定接头互联、为连接接头的双链DNA,若采用Qubit定量文库可能会虚高,所以针对文库精准定量,im体育App推出Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?扩增引物对根据Illumina文库接头序列P5和P7设计,可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子,从而实现Illumina文库精准定量。

稳定性检测.jpg

精准度分析.jpg

图6.Qubit定量稳定性与精确性对比 

随着国内基于NGS技术的基因测序市场的持续发展,im体育App将会根据客户需求推出基于NGS检测的全流程解决方案,加速推进国产试剂的替换进程,帮助客户创造价值,让世界更健康更快乐。


订购信息



产品名称

产品编号

规格

MolPure? Magnetic FFPE DNA Kit  磁珠法FFPE DNA提取试剂盒

18371ES50

50T

Hieff NGS? OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina? DNA 酶切法建库试剂盒

12205ES24

12205ES96

24T

96T

Hieff NGS? OnePot Pro DNA Library Prep Kit for MGI? DNA 酶切法建库试剂盒

13322ES16

13322ES96

16T

96T

Hieff NGS? Stubby UDI Primer Kit for Illumina?  UDI接头

12404ES01

12405ES01

12406ES01

12407ES01

12×2T

96×2T

192×1T

384×1 T

Hieff NGS? Unique Dual Index Primer Kit for MGI? Set 1

13451ES02

13451ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS? Unique Dual Index Primer Kit for MGI? Set 2

13452ES02

13452ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS? Unique Dual Index Primer Kit for MGI? Set 3

13453ES02

13453ES04

 

 

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS? Unique Dual Index Primer Kit for MGI? Set 4

13454ES02

13454ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS? DNA Selection Beads 分选磁珠

12601ES08

12601ES56

12601ES75

5mL

60mL

450mL

dsDNA HS Assay Kit for Qubit?  Qubit试剂

12640ES60

12640ES76

100T

500T

1×dsDNA HS Assay kit for Qubit?  Qubit预混液

12642ES60

12642ES76

100T

500T

Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?, qPCR Master MixqPCR文库定量

12302ES05

500T

Hieff NGS? Library dilution buffer 文库稀释液 

12303ES50

50 mL

Hieff NGS?Library Quantification Kit for Illumina?, DNA Standard 1-6  qPCR标准品

12307ES09

6×96μL



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